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鋁吸附疫苗產(chǎn)品穩(wěn)定性研究與方法

鋁化合物作為人用疫苗佐劑已有75年以上的歷史，是人用和獸用疫苗中使用最廣泛的佐劑。數(shù)十億劑含鋁鹽的疫苗已安全地用于全球不同的人群。盡管它們被廣泛使用，但關(guān)于這些產(chǎn)品的作用機(jī)制和穩(wěn)定性研究的監(jiān)管指南或者已發(fā)表的文獻(xiàn)很少。盡管在治療性蛋白化學(xué)和物理穩(wěn)定性方面的知識(shí)取得了很大進(jìn)展，但很少有已發(fā)表的將生物分析穩(wěn)定性方法應(yīng)用于蛋白質(zhì)吸附到鋁佐劑上的例子。本文介紹了鋁吸附疫苗，并討論了抗原穩(wěn)定性的研究。

　　鋁吸附疫苗

　　早期的疫苗佐劑使用的是明礬沉淀物制備的，這可能是異質(zhì)的。之后，預(yù)先形成的氫氧化鋁凝膠和后來(lái)的磷酸鋁取代了明礬沉淀，并產(chǎn)生了鋁吸附疫苗的標(biāo)準(zhǔn)化配方。隨著重組表達(dá)蛋白抗原的鑒定，鋁基佐劑繼續(xù)用于新疫苗制劑中，可以作為滅活或減毒病原體的更安全替代品。此外，含有將鋁與合成和天然配體連接起來(lái)的組合佐劑的疫苗已獲批準(zhǔn)。通常需要添加佐劑來(lái)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)和對(duì)可能不具有強(qiáng)免疫原性的蛋白質(zhì)抗原進(jìn)行有效的免疫。然而，鋁佐劑的作用方式，我們還沒有完全理解。潛在的機(jī)制包括鋁在注射部位形成一個(gè)局部的高濃度范圍，抗原從中緩慢釋放;吸附疫苗的顆粒形式導(dǎo)致巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突細(xì)胞攝取;并且直接刺激免疫系統(tǒng)。此外，有人提出蛋白質(zhì)在鋁凝膠上的吸附會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，從而增加蛋白質(zhì)的免疫原性。

　　人用疫苗中常用的鋁鹽制劑有兩種：氫氧化鋁(Alhydrogel)和磷酸鋁(Adju-Phos)。鋁佐劑的凈表面電荷為零時(shí)的pH值稱為零電荷點(diǎn)(point of zero charge，PZC)，類似于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)。當(dāng)溶液pH值低于PZC時(shí)，佐劑表面帶正電，當(dāng)溶液pH值大于PZC時(shí)，佐劑表面帶負(fù)電。氫氧化鋁的PZC約為11，磷酸鋁的PZC為4-5.5，但應(yīng)考慮疫苗制劑中使用的緩沖液，因?yàn)楸砻娴碾x子置換可能會(huì)降低PZC并影響對(duì)抗原的吸附。對(duì)于許多蛋白質(zhì)，抗原吸附在蛋白質(zhì)抗原的pI和鋁佐劑的PZC之間的pH內(nèi)最好，因?yàn)樵诖藀H范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)抗原和佐劑具有相反的電荷。因此，溶菌酶的pI為11.35，已被用作磷酸鋁研究中的模型抗原。牛血清白蛋白(pI為4.7)和卵清蛋白(pI為4.5)更有效地與氫氧化鋁結(jié)合。通常，Alhydrogel比Adju-Phos 具有更高的吸附能力，并且Alhydrogel的吸附能力隨著其粒徑的增加和蛋白質(zhì)分子量的增加而降低。已被用作磷酸鋁研究中的模型抗原。牛血清白蛋白(pI為4.7)和卵清蛋白(pI為4.5)更有效地與氫氧化鋁結(jié)合。蛋白質(zhì)對(duì)鋁佐劑的吸附機(jī)制尚不完全清楚，可能是物理現(xiàn)象的組合，包括“靜電引力、氫鍵、非極性相互作用、配體交換和范德華力”。對(duì)模型蛋白的研究發(fā)現(xiàn)靜電相互作用是溶菌酶、人類生長(zhǎng)激素、白喉類毒素、單克隆抗體和聚乙二醇化生長(zhǎng)激素的主要吸附機(jī)制，但對(duì)于卵清蛋白，吸附涉及配體交換。氫氧化鋁吸附HBsAg的主要機(jī)制被確定為HBsAg中的磷脂與氫氧化鋁佐劑中的表面羥基之間的配體交換。當(dāng)磷酸鹽緩沖液的濃度增加時(shí)，HBsAG與硫酸羥基磷酸鋁佐劑結(jié)合得更緊密。吸附強(qiáng)度與疫苗有效性的相關(guān)性與吸附機(jī)制有關(guān)。通過(guò)配體交換吸附的磷酸化蛋白質(zhì)在高吸附強(qiáng)度與較差的抗原呈遞和免疫反應(yīng)之間具有反比關(guān)系。對(duì)三價(jià)肺炎球菌蛋白疫苗的研究表明，佐劑的選擇會(huì)影響免疫原性，從而導(dǎo)致免疫原性的差異，并發(fā)現(xiàn)抗原表面微環(huán)境pH值較低和吸附強(qiáng)度降低可改善抗原穩(wěn)定性。吸附強(qiáng)度與疫苗有效性的相關(guān)性與吸附機(jī)制有關(guān)。通過(guò)配體交換吸附的磷酸化蛋白質(zhì)在高吸附強(qiáng)度與較差的抗原呈遞和免疫反應(yīng)之間具有反比關(guān)系。

　　吸附后抗原穩(wěn)定性

　　疫苗制劑開發(fā)的一個(gè)重大挑戰(zhàn)是了解吸附后的抗原穩(wěn)定性。雖然鋁沉淀和鋁吸附疫苗已經(jīng)使用了75年，但只有在過(guò)去15年中才報(bào)道了研究吸附對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性影響的研究，是因?yàn)殚_發(fā)了表征重組體的新技術(shù)被應(yīng)用于疫苗研究�？茖W(xué)家描述了佐劑表面的蛋白質(zhì)環(huán)境與溶液中的環(huán)境有何不同，這可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化。具體來(lái)說(shuō)，對(duì)吸附在氫氧化鋁上的1-磷酸葡萄糖(G1P)的酸催化水解速率的研究得出結(jié)論，佐劑表面微環(huán)境的pH值比本體溶液的pH值高約兩個(gè)pH單位。佐劑表面極性和電荷密度的差異也可能導(dǎo)致結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)的變化。

　　光譜方法已應(yīng)用于研究由吸附引起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)擾動(dòng)。包括熒光光譜、透射傅里葉變換紅外 (FTIR)光譜、使用衰減全反射(ATR)池的FTIR光譜，以及圓二色性(CD)。差示掃描量熱法(DSC)也已被應(yīng)用。在模型疫苗的研究中，通過(guò)FTIR-ATR、熒光光譜技術(shù)和DSC通過(guò)吸附觀察到結(jié)構(gòu)變化。使用透射FTIR的研究得出結(jié)論，在六種模型蛋白質(zhì)的研究中，吸附?jīng)]有導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化�？傮w而言，研究表明緩沖液濃度的變化，緩沖液pH值和抗原本身的特性可能會(huì)影響吸附的蛋白質(zhì)抗原的結(jié)構(gòu)。在乙型肝炎疫苗的研究中，抗原和氫氧化鋁佐劑之間的相互作用通過(guò)優(yōu)化磷酸根離子濃度而改變，并可能確保維持抗原的天然濃度。雖然沒有提供結(jié)構(gòu)信息，但得出了結(jié)論，含有40mM磷酸鹽的制劑通過(guò)以下方式提高了熱穩(wěn)定性。通過(guò)優(yōu)化磷酸根離子濃度來(lái)改變抗原和氫氧化鋁佐劑之間的相互作用，并確保維持抗原的天然濃度。此外，F(xiàn)TIR-ATR研究確定結(jié)構(gòu)變化取決于吸附的蛋白質(zhì)量，在具有最大吸附量的樣品中觀察到更多的蛋白質(zhì)。我們推測(cè)，在較低的吸附濃度下，會(huì)形成一個(gè)單分子層，其中吸附蛋白質(zhì)受佐劑表面性質(zhì)的影響，并且更加具有可變性。在更高的吸附水平下，蛋白質(zhì)的連接更弱，可能會(huì)保留天然結(jié)構(gòu)，雖然鋁吸收疫苗特性研究的重點(diǎn)是蛋白質(zhì)抗原結(jié)構(gòu)。

　　疫苗穩(wěn)定性研究的監(jiān)管指南

　　關(guān)于鋁吸附疫苗的作用機(jī)制和穩(wěn)定性測(cè)試方法幾乎沒有一般性指導(dǎo)文件。FDA文件《疫苗或相關(guān)產(chǎn)品的工業(yè)指南、化學(xué)、制造和控制信息的內(nèi)容和格式以及企業(yè)描述信息》指出，藥物產(chǎn)品發(fā)布規(guī)范中應(yīng)包括特性、純度和效力，但不提供具體的測(cè)試方法或指導(dǎo)。美國(guó)藥典(USP)第<1235>章人用疫苗——一般注意事項(xiàng)沒有提供超出效力、一般安全性、無(wú)菌性、純度、特性和成分材料測(cè)試的一般要求的釋放和穩(wěn)定性測(cè)試的具體建議。目前，只有一部鋁吸附疫苗 USP專著(Anthrax Vaccine Adsorbed)，但在2018年8月被刪停用。該指導(dǎo)包括對(duì)不含鋁的無(wú)菌濾液進(jìn)行的測(cè)試。對(duì)無(wú)菌濾液進(jìn)行的測(cè)試包括蛋白質(zhì)印跡鑒定、根據(jù)USP<1057>使用Bradford測(cè)定法檢測(cè)總蛋白和使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)蛋白質(zhì)。成品測(cè)試包括在體內(nèi)相對(duì)效價(jià)、原子吸收光譜法測(cè)定鋁濃度、安全性、無(wú)菌性、pH值、離子選擇性探針測(cè)定氯化鈉、滴定法測(cè)定芐索氯銨，以及使用紫外-可見光譜法測(cè)定甲醛的限度測(cè)試。

　　雖然沒有關(guān)于包含效力指示的測(cè)試方法的具體指導(dǎo)，但可以從國(guó)際協(xié)調(diào)委員會(huì)(ICH)Q5E可比性的生物技術(shù)/生物制品的可比性中得出一些相似之處。在他們的制造過(guò)程中，該指南指出，“制造商應(yīng)考慮生物測(cè)定的局限性，例如高變異性，這可能會(huì)阻止檢測(cè)由于制造過(guò)程變化而發(fā)生的差異�！比欢仓赋�，“在生物測(cè)定還作為物理化學(xué)分析的補(bǔ)充(例如，作為高階結(jié)構(gòu)的替代測(cè)定)的情況下，使用具有適當(dāng)精密度和準(zhǔn)確度的相關(guān)生物測(cè)定可能會(huì)提供合適的確認(rèn)特定高階結(jié)構(gòu)在制造過(guò)程更改后沒有發(fā)生變化的方法。”雖然此分析的目的是評(píng)估穩(wěn)定性而不是制造變化，但該指南可以外推到穩(wěn)定性測(cè)試方法。

　　測(cè)試方法

　　理想情況下，為吸附的疫苗產(chǎn)品提供穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的測(cè)試方法不需要大量的樣品制備或從佐劑中解吸抗原。有多種不同的適用于解吸的機(jī)制，但都有共同的缺點(diǎn)。解吸過(guò)程本身可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)抗原中的結(jié)構(gòu)變化或額外的修飾或雜質(zhì)。對(duì)于大多數(shù)測(cè)試方法中的分析，解吸的樣品需要進(jìn)行緩沖液交換步驟，這將導(dǎo)致溶液濃度未知，在通過(guò)穩(wěn)定性指示方法進(jìn)行分析之前，必須使用單獨(dú)的分析來(lái)確定該濃度。最后，解吸回收率可能會(huì)有所不同，樣品的回收率可能會(huì)降低。

　　根據(jù)其定義，未結(jié)合抗原的測(cè)量是在未解吸的成品(finished drug product，F(xiàn)DP)上進(jìn)行的。該測(cè)試方法的目的是測(cè)量未從鋁佐劑吸附或已解吸的游離蛋白質(zhì)的量。通過(guò)離心制備樣品，并除去上清液進(jìn)行分析。通常，色譜法用于根據(jù)相同蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)量化樣品中游離蛋白質(zhì)的量。色譜方法各不相同，可能包括尺寸排阻色譜(SEC)或反相高效液相色譜(RP-HPLC)。典型的方法可以基于用于分析抗原原料藥(bulk drug substance，BDS)的方法，然后針對(duì)靈敏度進(jìn)行優(yōu)化并使用低水平標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行驗(yàn)證。

　　一些免疫學(xué)測(cè)試方法在Alhydrogel或磷酸鋁存在的情況下是可行的，可用于鑒定，或在某些情況下，無(wú)需解吸即可進(jìn)行定量。雖然蛋白質(zhì)印跡不是一種實(shí)用的替代方法，因?yàn)镾DS-PAGE不能在FDP上進(jìn)行，但狹縫印跡和點(diǎn)印跡消除了分離步驟。在狹縫印跡或斑點(diǎn)印跡法中，產(chǎn)品直接施加到膜上，并可以使用微濾裝置和真空將其拉過(guò)膜�？梢愿鶕�(jù)需要進(jìn)行額外的沖洗，以確保沒有表面殘留物留在膜上。在將樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照應(yīng)用于膜后，將膜從裝置中取出并使用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行免疫印跡。雖然沒有確定公開的程序描述使用點(diǎn)或狹縫印跡分析鋁吸附疫苗，但該技術(shù)用于定量流感疫苗中的血凝素和神經(jīng)氨酸酶的分析。點(diǎn)和狹縫印跡的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)分析多個(gè)樣本，并且可以將膜切成條狀以使用多種抗體進(jìn)行免疫印跡，從而可以同時(shí)識(shí)別多種抗原。有文獻(xiàn)也證明了直接鋁凝膠制劑免疫測(cè)定(DAFIA)用于確定抗原身份和含量的可行性。在該方法中，將FDP添加到黑色多滴定板的孔中。離心和洗滌后，封閉孔，然后用一抗探測(cè)，然后用熒光素標(biāo)記的二抗探測(cè)。

　　可以使用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)直接測(cè)定鋁佐劑的濃度。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)定量方法，例如UV-Vis光譜或RP-HPLC不適用于結(jié)合抗原。USP方法6<1057>利用鄰苯二甲醛(OPA)已應(yīng)用于鋁水凝膠疫苗。OPA與N端胺基或賴氨酸側(cè)鏈上的胺基反應(yīng)，并在340nm/455nm處產(chǎn)生熒光信號(hào)。FDP的蛋白質(zhì)濃度與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。OPA方法應(yīng)用于含有Alhydrogel的瘧疾候選疫苗，并確定為獲得準(zhǔn)確結(jié)果，Alhydrogel 必須以與樣品相同的濃度包含在標(biāo)準(zhǔn)中。準(zhǔn)確度為87-100%，線性范圍為25-400μg/mL。在內(nèi)部研究中，該方法使用非線性曲線擬合的范圍為20-250μg/mL，結(jié)果準(zhǔn)確度為98-110%，樣品重復(fù)性≤2%(參見下圖1中的代表性標(biāo)準(zhǔn)曲線)。

　　圖1.模型疫苗的鄰苯二甲醛(OPA)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　有人也提倡將生物制藥開發(fā)中常見的制劑前研究應(yīng)用于含鋁佐劑的疫苗。除了表征佐劑和游離抗原外，還建議評(píng)估抗原-佐劑配方，以了解吸附強(qiáng)度以及蛋白質(zhì)抗原的結(jié)構(gòu)和化學(xué)穩(wěn)定性。

　　HPLC不適合分析完整的鋁吸附FDP，因?yàn)橐呙绶肿訒?huì)被柱篩板過(guò)濾，或者如果它們確實(shí)進(jìn)入柱子，會(huì)導(dǎo)致柱堵塞和背壓增加。RP-HPLC已應(yīng)用于濃度測(cè)量，并在一定程度上用于解吸后疫苗的化學(xué)穩(wěn)定性。雖然對(duì)完整抗原進(jìn)行色譜分析需要進(jìn)行解吸步驟，但肽圖分析提供了一種強(qiáng)大的工具來(lái)驗(yàn)證FDP的身份以及評(píng)估吸附后和穩(wěn)定性期間抗原的化學(xué)穩(wěn)定性。在肽譜分析中，蛋白質(zhì)被酶(如LysC或胰蛋白酶)消化以產(chǎn)生一組肽。所得的肽混合物可以通過(guò)色譜法分離，并與對(duì)照或BDS進(jìn)行比較，或者可以通過(guò)質(zhì)譜法進(jìn)行分析，并與基于一級(jí)序列的肽的預(yù)期質(zhì)量進(jìn)行比較。還可以使用帶飛行時(shí)間檢測(cè)(MALDI-TOF)的基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜法分析肽混合物，而無(wú)需進(jìn)行分離。Lys C消化解吸抗原，然后對(duì)含有Alhydrogel的三價(jià)肉毒桿菌疫苗進(jìn)行MALD-TOF分析，檢測(cè)到所有三種蛋白質(zhì)抗原的氧化和脫酰胺反應(yīng)，并且在佐劑存在下反應(yīng)速率加快。最初使用250mM琥珀酸鹽緩沖液(pH3.5)解吸樣品，但在孵育后，解吸變得更加困難，因此需要使用4M尿素pH7.5緩沖液。解吸本身使分析復(fù)雜化，因?yàn)槭紫�，它可能無(wú)法完全重現(xiàn)，特別是對(duì)于穩(wěn)定性樣品，其次，它可能導(dǎo)致額外的降解。在未發(fā)表的研究中，胰蛋白酶用于成功消化與Alhydrogel結(jié)合的抗原而不會(huì)解吸。在pH8.0的Tris/HCL緩沖液中，在37℃下孵育4小時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)消化程序，然后是使用ACN/TFA流動(dòng)相和C18柱的RP-HPLC。色譜圖(參見下圖2)消化后的FDP與消化后的BDS緊密匹配，表明非解吸肽圖是評(píng)估FDP中抗原穩(wěn)定性的可行方法。隨著高質(zhì)量準(zhǔn)確度/高分辨率質(zhì)譜儀的可用性不斷提高，肽圖分析已演變?yōu)槎鄬傩苑椒?multi-attributemethod，MAM)，它可以替代治療性蛋白質(zhì)的多種電泳和色譜穩(wěn)定性指示方法。MAM在鋁吸附疫苗中的應(yīng)用有機(jī)會(huì)進(jìn)一步了解蛋白質(zhì)抗原穩(wěn)定性并改進(jìn)分析以支持質(zhì)量源于設(shè)計(jì)(QbD)的開發(fā)以及質(zhì)量控制(QC)的批放行。

　　圖2.未消化的BDS(藍(lán)色)、消化的BDS(紅色)、消化的成品(FDP)(綠色)、BDS空白(粉色)、FDP空白(藍(lán)色)和胰蛋白酶空白(紫色)的UV220nm色譜圖。

　　MAM有可能取代在分析前都需要解吸的電泳和色譜穩(wěn)定性指示方法。解吸方法從使用磷酸鹽緩沖液pH7.4、磷酸鹽緩沖液和Zwittergent、250mM琥珀酸鹽緩沖液pH3.5到更苛刻的條件，例如20mM十二烷基硫酸鈉(SDS)或20mM氯化十六烷基吡啶檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液和高達(dá)4M的尿素。多位研究人員指出，穩(wěn)定性樣品的解吸更具挑戰(zhàn)性。因此，穩(wěn)定性指示方法的解吸程序的開發(fā)應(yīng)盡可能使用穩(wěn)定性樣品進(jìn)行。解吸方法的選擇將根據(jù)所使用的佐劑以及預(yù)期的分析方法和與解吸溶液的兼容性而有所不同。例如，在實(shí)驗(yàn)中使用SDS的方法(例如 SDS-PAGE或CE-PAGE)制備樣品時(shí)，SDS將是解吸緩沖液的不錯(cuò)選擇。此外，SDS不會(huì)顯著干擾RP-HPLC。尿素通常用于毛細(xì)管電泳(ICE)成像程序的樣品制備，并且是制備用于電荷分離方法(如ICE和離子交換色譜(IEX))的樣品的首選緩沖液。使用SDS進(jìn)行解吸的標(biāo)準(zhǔn)方案包括以下步驟：尿素通常用于毛細(xì)管電泳(ICE)成像程序的樣品制備，并且是制備用于電荷分離方法(如ICE和離子交換色譜(IEX))的樣品的首選緩沖液。使用SDS進(jìn)行解吸的標(biāo)準(zhǔn)方案包括以下步驟：

　　混合緩沖液、SDS和疫苗FDP，并在70℃下孵育10分鐘。

　　離心，去除上清液，并使用RP-HPLC測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。確保參考標(biāo)準(zhǔn)中的SDS濃度與樣品中的濃度相匹配。

　　使用超濾過(guò)濾器濃縮并用水洗滌脫鹽。在分析前利用體積確定近似濃度。

　　尿素解吸的標(biāo)準(zhǔn)步驟遵循類似的程序：

　　混合緩沖液、尿素和疫苗FDP，并在冷藏條件下?lián)u晃18小時(shí)。

　　離心，去除上清液，并使用RP-HPLC測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。確保參考標(biāo)準(zhǔn)品中的尿素濃度與樣品中的尿素濃度相匹配。

　　透析樣品以降低尿素濃度。

　　重復(fù)RP-HPLC分析以確定濃度，使用超濾過(guò)濾器濃縮并用水洗滌脫鹽。

　　執(zhí)行ICE或IEX分析。

　　解吸后，可以使用標(biāo)準(zhǔn)程序和商業(yè)凝膠和試劑進(jìn)行SDS-PAGE。如下圖3所示的模型疫苗的分析使用預(yù)制凝膠(Thermo Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris)和推薦的樣品和運(yùn)行緩沖液(NuPAGE LDS樣品緩沖液和NuPAGE MOPS SDS運(yùn)行緩沖液)。凝膠已在 37℃下儲(chǔ)存0至5天的SDS解吸模型疫苗樣品的分析結(jié)果。上樣前將樣品還原并使用考馬斯藍(lán)染色劑(NuPAGE膠體藍(lán)染色試劑盒)染色。通過(guò)光密度測(cè)定法(Bio-Rad GS-800密度計(jì)和Quantity One軟件)分析凝膠是否存在由于降解以及純度百分比導(dǎo)致的額外條帶。主條帶的純度范圍從第0天樣品的96%到第4天和第5天的90-91%，因此證明解吸SDS-PAGE方法具有穩(wěn)定性指示。

　　圖3.用于熱處理樣品的模型疫苗十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠。MW=分子量標(biāo)記，RS=標(biāo)準(zhǔn)，C=對(duì)照樣品，T0-T5=37℃下儲(chǔ)存的天數(shù)，B=空白，S=靈敏度標(biāo)準(zhǔn)。

　　模型BSA-Alhydrogel疫苗的ICE分析是使用成像毛細(xì)管電泳系統(tǒng)進(jìn)行的，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm(ICE280和ICE3系統(tǒng)，ProteinSimple)。如前所述，使用尿素解吸和透析制備樣品，然后使用超濾過(guò)濾器濃縮。樣品、參考物質(zhì)和對(duì)照樣品在稀釋劑中稀釋，稀釋劑由緩沖液4-6.5、緩沖液液3-10、1g/mL尿素、0.7%甲基纖維素和pI標(biāo)記物5.12和6.61組成。使用酸性陽(yáng)極電解液(0.1%甲基纖維素，0.08M H3PO4)、堿性陰極電解液(0.1%甲基纖維素，0.10M NaOH)進(jìn)行分析，并在3000V下分離10分鐘。分析所得電泳圖(ChromPerfect 7軟件)的同種型純度。模型疫苗樣品在分析前在37℃下儲(chǔ)存0至5天。下圖4的電泳圖疊加顯示了每個(gè)樣品的異構(gòu)體分布。在非降解樣品中，在pI6.1和6.2處觀察到主峰，但在37℃下儲(chǔ)存更長(zhǎng)時(shí)間后，觀察到顯著轉(zhuǎn)變?yōu)楦嵝缘耐N型。解吸ICE方法是穩(wěn)定性指示，用于檢測(cè)異構(gòu)體分布的變化。

　　圖4.已在37℃下儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)五天的尿素解吸樣品的成像毛細(xì)管電泳(ICE)電泳圖疊加。

　　結(jié)論

　　鋁吸附疫苗的性質(zhì)對(duì)通常用于治療性蛋白質(zhì)穩(wěn)定性研究的傳統(tǒng)生物分析方法的應(yīng)用提出了挑戰(zhàn)。雖然研究表明吸附導(dǎo)致蛋白質(zhì)抗原的結(jié)構(gòu)和化學(xué)修飾，并且吸附可能影響穩(wěn)定性，但除了推薦之外，幾乎沒有提供監(jiān)管指導(dǎo)，包括藥物產(chǎn)品放行測(cè)試中的特性、純度和效力。效力方法可能沒有必要的準(zhǔn)確性和精確度來(lái)預(yù)測(cè)疫苗在整個(gè)產(chǎn)品保質(zhì)期內(nèi)的有效性和穩(wěn)定性。取而代之的是，下表1中提出了一組改編自傳統(tǒng)治療性蛋白質(zhì)分析的測(cè)試。盡管從歷史上看，抗原表征是在解吸后進(jìn)行的，但大多數(shù)提出的方法都可以直接在FDP上進(jìn)行。隨著基于MS的肽圖分析方法(例如MAM)的日益普及，可能不再需要先解吸再使用電泳和色譜方法來(lái)確定碎片或化學(xué)修飾。